کشت سلولی

کشت سلولی چیست؟

کشت سلولی چیست؟ در این بخش از مقاله به توضیح کشت سلولی می پردازیم. کشت سلولی ابزار بسیار متنوعی در بررسی سوالات پایه علمی و تحقیقات ترجمه است. مزیت استفاده از رده های سلولی در تحقیقات علمی، همگن بودن آنها و قابلیت تکرارپذیری مرتبط در داده های تولید شده است.

این فصل اصول راه اندازی یک آزمایشگاه کشت سلولی و دستورالعمل هایی را معرفی می کند که ایمنی پرسنل آزمایشگاه و همچنین سلول های کشت شده را تضمین می کند. همچنین به آلاینده‌های میکروبیولوژیکی بالقوه و نحوه جلوگیری از آن‌ها و همچنین تشخیص زودهنگام آنها می‌پردازد.

از آنجایی که انتخاب یک رده سلولی خاص و شرایط کشت سلولی خاص به بازخوانی روش مورد نظر بستگی دارد، کشت سلولی به روش های آزمایشگاهی اطلاق می شود که امکان رشد سلول های یوکاریوتی یا پروکاریوتی را در شرایط فیزیولوژیکی فراهم می کند. منشأ آن را می توان در اوایل قرن بیستم پیدا کرد، زمانی که برای مطالعه رشد و بلوغ بافت، زیست شناسی ویروس و توسعه واکسن، نقش ژن ها در بیماری و سلامت، و استفاده از رده های سلولی هیبریدی در مقیاس بزرگ برای تولید داروهای زیستی معرفی شد. کاربردهای تجربی سلول‌های کشت‌شده به اندازه انواع سلول‌هایی است که می‌توانند در شرایط آزمایشگاهی رشد کنند.

با این حال، در زمینه بالینی، کشت سلول معمولاً با ایجاد سیستم‌های مدلی مرتبط است که زیست‌شناسی سلولی پایه را مطالعه می‌کنند، مکانیسم‌های بیماری را تکرار می‌کنند، یا سمیت ترکیبات دارویی جدید را به کمک تست mtt بررسی می‌کنند. یکی از مزایای استفاده از کشت سلول برای این کاربردها امکان دستکاری ژن ها و مسیرهای مولکولی است.

علاوه بر این، همگنی جمعیت های سلولی کلونال یا انواع سلول های خاص و سیستم های کشت به خوبی تعریف شده، متغیرهای ژنتیکی یا محیطی مداخله گر را حذف می کند و بنابراین امکان تولید داده هایی با قابلیت تکرارپذیری و سازگاری بالا را فراهم می کند که نمی توان آن را هنگام مطالعه سیستم های کل اندام تضمین کرد.

ایمنی آزمایشگاهی کشت سلولی کاربرد هیجان انگیز تکنیک های  کشت سلول در تحقیقات زیست پزشکی مستلزم مدیریت خطرات بالقوه مرتبط با عوامل عفونی موجود در سلول های کشت شده (مانند HBV یا HIV)، اما همچنین کنترل معرف هایی است که می توانند سمی، خورنده باشند. یا ماهیت جهش زا این خطرات بالقوه می توانند در صورت وارد شدن به بدن (به عنوان مثال از طریق تماس پوست و غشاهای مخاطی با مواد جامد، مایعات یا ذرات معلق در هوا) سلامت کارکنان آزمایشگاه را به خطر بیندازند و در صورت استفاده نادرست محیط را تهدید کنند.

بنابراین قبل از شروع هر کار کشت سلولی، کاهش یا حذف قرار گرفتن در معرض عوامل بالقوه خطرناک باید اطمینان حاصل شود تا عفونت، بیماری زایی، واکنش های آلرژیک و تماس با سموم آزاد شده به حداقل برسد. این را می توان با آموزش دقیق پرسنل آزمایشگاه و اجرای شیوه های استاندارد کشت سلولی، که باید به طور منظم توسط اعضای آزمایشگاه و کمیته ایمنی موسسه بررسی و بازنگری شود، به دست آورد.

علاوه بر این، هنگام کار با سلول‌های اولیه که مستقیماً از بافت انسانی جدا شده‌اند، غربالگری اهداکنندگانی که سلول‌ها از آنها مشتق شده‌اند برای پاتوژن‌های بیماری‌زا مهم است. ایمن سازی های به روز در برابر بیماری های عفونی مانند هپاتیت B نیز برای کارکنان آزمایشگاهی که با سلول های اولیه کار می کنند بسیار توصیه می شود.

انواع کشت سلولی

دو نوع اصلی کشت وجود دارد: کشت های اولیه (فانی) و کشت رده های سلولی تثبیت شده (جاودانه). کشت های اولیه شامل سلول ها، بافت ها یا اندام های طبیعی هستند که مستقیماً از بافت جمع آوری شده توسط بیوپسی از یک موجود زنده جدا می شوند. در مقابل، رده های سلولی جاودانه می توانند به طور نامحدود تداوم داشته باشند. چنین خطوط سلولی معمولاً از بیوپسی های تومور از بیماران مشتق می شوند، یا ممکن است از سلول های اولیه ای که تحت جهش هایی قرار گرفته اند تولید شوند که آنها را قادر می سازد بر محدودیت هایفلیک غلبه کنند و به تکثیر ادامه دهند.

اصطلاحات رایج و پر کاربرد در کشت سلولی

اصطلاحات مختلفی در کشت سلول استفاده می شود که بعضی از آنها عبارت اند از:

• Asepsis: بدون عفونت یا میکروارگانیسم های آلوده کننده.
• Aseptic technique: روش‌هایی که برای جلوگیری از ورود قارچ‌ها، باکتری‌ها، ویروس‌ها، مایکوپلاسما یا سایر میکروارگانیسم‌ها به کشت‌های سلولی، بافتی و اندام استفاده می‌شوند. اگرچه این روش‌ها برای جلوگیری از آلودگی میکروبی کشت‌ها استفاده می‌شوند، اما از آلودگی متقاطع کشت‌های سلولی نیز جلوگیری می‌کنند. این روش ها ممکن است معرفی مولکول های عفونی را رد کند یا نکند.
• Cell line: یک رده سلولی از یک کشت اولیه در زمان اولین subculture موفق به وجود می آید. اصطلاح رده سلولی به این معناست که کشت‌های حاصل از آن شامل دودمان‌هایی از سلول‌هایی است که در اصل در کشت اولیه وجود دارند.
• Cryopreservation: ذخیره سازی سلول ها، بافت ها، یا جنین ها در دمای بسیار پایین. این ذخیره سازی معمولاً با استفاده از دمای زیر 100 درجه سانتیگراد انجام می شود.
• Explant: بافت از محل اصلی خود گرفته شده و برای رشد یا نگهداری به محیط مصنوعی منتقل می شود.
• Organ culture: نگهداری یا رشد اندام پریموردیا یا کل یا بخش هایی از یک اندام در شرایط آزمایشگاهی به گونه ای که امکان تمایز و حفظ معماری و/یا عملکرد را فراهم کند.
• Passage: انتقال یا جابجایی سلول ها، با یا بدون رقت، از یک ظرف کشت به ظرف دیگر. این اصطلاح مترادف با اصطلاح «subculture» است.

شرایط مناسب کشت سلول

کشت های سلولی باید در انکوباتور با دمای کاملاً تنظیم شده و غلظت CO2 انکوبه شوند. اکثر رده های سلولی در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد CO2 با رطوبت اشباع رشد می کنند، اما برخی از انواع سلول ها نیاز به جوجه کشی در دماهای پایین تر و/یا غلظت CO2 کمتر دارند.

جداسازی سلول‌ چیست؟

جداسازی سلولی فرآیند جداسازی تک تک سلول های زنده از یک بلوک جامد از بافت یا سوسپانسیون سلولی است. در حالی که برخی از انواع سلول ها به طور طبیعی به شکل جداگانه وجود دارند، انواع سلول های دیگر که در بافت جامد یافت می شوند نیاز به تکنیک های خاصی برای جداسازی آنها به سلول های جداگانه دارند.

مراحل کشت سلول

فرآیندها و مراحل کشت سلولی بسته به نوع سلول و کاربرد متفاوت است. ما باید آگاه باشیم که اگر سلول ها به شیوه ای مناسب برای هر فرآیند مدیریت نشوند، ممکن است ویژگی های آنها تغییر کند. مراحل کشت سلول به شرح ذیل می باشد:

• Cell isolation: دو روش برای به دست آوردن سلول وجود دارد: از بانک سلولی یا جداسازی سلول ها از بافت دهنده. هنگام شروع کشت از سلول های به دست آمده از بانک سلولی، فرد باید مراحل “ذوب”، “کشت سلولی” و “مشاهده سلولی” را طی کند.هنگام استفاده از بافت جمع‌آوری‌شده از اهداکننده، معمولاً بافت غیرضروری در صورت چسباندن برداشته می‌شود.

دو روش عمده برای جداسازی سلول ها از بافت وجود دارد، explant culture و روش آنزیمی. در روش های آنزیمی، جداسازی سلول ها از بافت مورد نظر با استفاده از محلول آنزیمی پروتئولیتیک. در صورت استفاده از آنزیم، آنزیم را رقیق کرده و یا واکنش آنزیمی را با بازدارنده واکنش آنزیمی متوقف کنید، سپس مراحل “کشت سلولی” و “مشاهده سلول” را برای آماده سازی کشت سلولی ادامه دهید.

• Cell seeding: برای دستیابی به تراکم کشت سلولی هدف، مقدار محیط تازه مورد نیاز برای دستیابی به تراکم کشت سلولی مورد نظر را بر اساس تعداد سلول های اندازه گیری شده محاسبه کنید و سوسپانسیون سلولی را بر این اساس رقیق کنید.

• Medium exchange: پس از ذوب شدن و بذر در یک ظرف کشت، سلول ها در انکوباتور CO2 شروع به رشد می کنند. سلول ها مواد مغذی را در محیط کشت متابولیزه می کنند، بنابراین محیطی که از مواد مغذی تهی شده و با متابولیت ها غنی شده است باید با محیط تازه جایگزین شود. به این فرآیند «تعویض محیط کشت» یا «جایگزینی محیط کشت» می گویند.

• Passage: هنگامی که سلول ها شروع به تکثیر کردند، آنها را قبل از پر شدن ظرف فعلی، به فلاسک های جدید انتقال می دهند. به این فرایند «Passage» می گویند. حالتی که در آن سلول ها رشد کرده اند تا ظرف کشت را پر کنند، “confluen” نامیده می شود. به طور کلی، توصیه می شود که سلول ها زمانی پاساژ داده شوند که ناحیه اشغال شده توسط سلول ها تقریباً به 70 تا 80 درصد در هر فلاسک برسد. سپس برای هدف مورد نظر استفاده شود.

کاربرد کشت سلولی

کشت سلولی یکی از مهم ترین تکنیک ها در زیست شناسی سلولی و مولکولی است زیرا بستری را برای بررسی بیولوژی، بیوشیمی، فیزیولوژی (به عنوان مثال، پیری) و متابولیسم سلول های wild-type و سلول های بیمار فراهم می کند.

آزمایشگاه کشت سلولی

ویژگی اصلی آزمایشگاه کشت سلولی، جدای از آزمایشگاه میکروبیولوژیکی، حفظ سطح بالایی از آسپسیس است. بسته به بیماری زایی کشت ها دو نوع آزمایشگاه کشت سلولی وجود دارد:

آزمایشگاه کشت بافت عمومی بدون عوامل بیماری زا. اساسا، این یک اتاق ایزوله با منبع هوای فیلتر شده با دمای کنترل شده (HEPA) است. با ورود این هوا، فشار اتمسفر داخل آزمایشگاه (معمولاً 20-15 پاسکال) افزایش می یابد که از ورود آلاینده های بیرونی (اتاق تمیز) جلوگیری می کند.

آزمایشگاه کشت با عوامل بیماری زا. برای جلوگیری از انتشار تصادفی عوامل بیماری زا، هوای خروجی با فیلتر HEPA فیلتر می شود و کسری فشار داخلی ایجاد می شود (حداقل 15 Pa). اگر هوای ورودی نیز نیاز به فیلتر کردن داشته باشد، جریان هوا باید طوری تنظیم شود که تعادل خالص اجازه دهد تا فشار منفی روی فضای داخلی حفظ شود. همچنین باید به هر تجهیزات دیگری که ممکن است بر این تعادل تأثیر بگذارد توجه شود (مانند کابینت های متصل به بیرون).

روش کشت سلول

کشت سلولی در اوایل قرن بیستم به عنوان روشی برای مطالعه رفتار سلول‌های حیوانی در محیطی عاری از تغییرات سیستمیکی که می‌توان در مدل های حیوانی در طول هموستاز طبیعی و استرس یک آزمایش یافت، توسعه یافت.

رده های سلولی در کشت سلولی

سویه سلولی، زیرجمعیتی از یک رده سلولی است که به طور مستقیم از کشت، با شبیه سازی یا روش های دیگر انتخاب شده است. یک سویه سلولی اغلب از زمان شروع رده سلولی مادر، دچار تغییرات ژنتیکی اضافی شده است.

کشت سلول جانوری چیست؟

کشت سلولی فرآیندی است که طی آن سلول های انسان، حیوان یا حشرات در یک محیط مصنوعی مناسب رشد می کنند. سلول ها ممکن است از یوکاریوت های چند سلولی، رده های سلولی از قبل ایجاد شده یا سویه های سلولی ایجاد شده مشتق شوند.

محیط کشت سلولی باید چگونه باشد؟

اگرچه اندامک ها و مولکول های بزرگ در یک سلول را می توان با میکروسکوپ تجسم کرد، اما درک نحوه عملکرد این اجزا به تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی دقیق نیاز دارد. اکثر روش‌های بیوشیمیایی مستلزم به دست آوردن تعداد زیادی سلول و سپس ایجاد اختلال فیزیکی در آنها برای جداسازی اجزای آنها هستند.

اگر نمونه یک تکه بافت، متشکل از انواع مختلف سلول ها باشد، جمعیت های سلولی ناهمگن با هم مخلوط می شوند. زیست شناسان برای به دست آوردن هرچه بیشتر اطلاعات در مورد یک نوع سلول، روش هایی را برای جدا سازی سلول ها از بافت ها و جداسازی انواع مختلف ایجاد کرده اند. این دستکاری‌ها منجر به جمعیت نسبتاً همگنی از سلول‌ها می‌شود که پس از آن می‌توان آن‌ها را تجزیه و تحلیل کرد – چه به طور مستقیم یا پس از اینکه تعداد آنها به میزان قابل توجهی افزایش یافته است و به سلول‌ها اجازه می‌دهند به عنوان یک کشت خالص تکثیر شوند.

سلول ها را می توان از یک سوسپانسیون بافتی جدا کرد و به انواع مختلف جدا کرد؟

اولین قدم در جداسازی سلول‌های یکنواخت از بافتی که حاوی مخلوطی از انواع سلولی است، مختل کردن ماتریکس خارج سلولی است که سلول‌ها را کنار هم نگه می‌دارد. بهترین بازده سلول های جدا شده زنده معمولاً از بافت های جنینی یا نوزادی به دست می آید. نمونه بافت معمولاً با آنزیم‌های پروتئولیتیک (مانند تریپسین و کلاژناز) برای هضم پروتئین‌ها در ماتریکس خارج سلولی و با عواملی (مانند اتیلن دی آمین تترا استیک اسید یا EDTA) که Ca2+ را که چسبندگی سلولی به آن بستگی دارد، متصل می‌کند یا کلات می‌کند، درمان می‌شود.

سپس بافت را می توان با تکان دادن ملایم به سلول های زنده تکه تکه کرد.چندین روش برای جداسازی سلول (انواع مختلف) از یک سوسپانسیون سلولی مخلوط استفاده می شود. یکی از تفاوت ها در خواص فیزیکی استفاده می کند. سلول های بزرگ را می توان از سلول های کوچک و سلول های متراکم را از سلول های سبک با سانتریفیوژ جدا کرد. این تکنیک‌ها در زیر در ارتباط با جداسازی اندامک‌ها و درشت مولکول‌ها، که در ابتدا برای آن ساخته شده‌اند، توضیح داده می‌شوند.

رویکرد دیگر مبتنی بر تمایل برخی از انواع سلول ها به چسبیدن قوی به شیشه یا پلاستیک است که به آنها اجازه می دهد از سلول هایی که چسبندگی کمتری دارند جدا شوند. در راستای جداسازی سلول، یک اصلاح مهم در این آخرین تکنیک به ویژگی های اتصال خاص آنتی بادی ها بستگی دارد.

آنتی بادی هایی که به طور خاص به سطح تنها یک نوع سلول در یک بافت متصل می شوند، می توانند به ماتریس های مختلفی مانند کلاژن، دانه های پلی ساکارید یا پلاستیک متصل شوند تا یک سطح میل ترکیبی ایجاد کنند که تنها سلول های شناسایی شده توسط آنتی بادی ها می توانند به آن بچسبند. سلول‌های متصل سپس با تکان دادن ملایم، با درمان با تریپسین برای هضم پروتئین‌هایی که واسطه چسبندگی هستند، یا در مورد ماتریکس قابل هضم (مانند کلاژن)، با تجزیه خود ماتریکس با آنزیم‌هایی (مانند کلاژناز) بازیابی می‌شوند. .

یکی از پیچیده‌ترین تکنیک‌های جداسازی سلولی، از آنتی‌بادی جفت شده با رنگ فلورسنت برای برچسب‌گذاری سلول‌های خاص استفاده می‌کند. سپس سلول‌های نشان‌دار شده را می‌توان در یک مرتب‌کننده سلولی فعال شده با فلورسانس الکترونیکی از سلول‌های بدون برچسب جدا کرد. در این دستگاه قابل توجه، سلول‌های منفرد که به صورت تک فایل در جریانی خوب حرکت می‌کنند، از پرتو لیزر عبور می‌کنند و فلورسانس هر سلول به سرعت اندازه‌گیری می‌شود.

یک نازل ارتعاشی قطرات ریز تولید می کند که اکثر آنها دارای یک سلول یا بدون سلول هستند. قطرات حاوی یک سلول واحد به طور خودکار در لحظه تشکیل بار مثبت یا منفی داده می شوند، بسته به اینکه سلولی که در آنها وجود دارد فلورسنت است یا خیر. سپس توسط یک میدان الکتریکی قوی به یک ظرف مناسب منحرف می شوند.

بیشتر بخوانید: مهندسی بافت چیست؟

توده های گاه به گاه سلول ها که با افزایش پراکندگی نور آنها شناسایی می شوند، بدون بار رها می شوند و در ظرف زباله دور ریخته می شوند. چنین ماشین هایی می توانند با دقت 1 سلول فلورسنت را از مجموعه ای از 1000 سلول بدون برچسب انتخاب کرده و در هر ثانیه چندین هزار سلول را مرتب کنند.

سلول‌های انتخابی را می‌توان با جدا کردن دقیق آنها از برش‌های بافت نازکی که برای بررسی میکروسکوپی تهیه شده‌اند، به‌دست آورد (در فصل 9 بحث شد). در یک رویکرد، یک بخش بافت با یک فیلم پلاستیکی نازک پوشانده می شود و ناحیه ای حاوی سلول های مورد نظر با یک پالس متمرکز از لیزر مادون قرمز تابش می شود.

این پالس نور، دایره کوچکی از فیلم را ذوب می کند و سلول های زیر آن را متصل می کند. سپس این سلول های گرفته شده برای تجزیه و تحلیل بیشتر حذف می شوند. این تکنیک که ریزشکن کردن لیزر نامیده می شود، می تواند برای جداسازی و تجزیه و تحلیل سلول ها از نواحی مختلف تومور استفاده شود و امکان مقایسه خواص آنها را فراهم کند.

یک روش مرتبط با استفاده از پرتو لیزر به طور مستقیم گروهی از سلول‌ها را جدا می‌کند و آنها را در یک ظرف مناسب برای تجزیه و تحلیل آینده منجنیق می‌کند. هنگامی که یک جمعیت یکنواخت از سلول ها به دست آمد – با ریزشکن یا با هر یک از روش های جداسازی که توضیح داده شد – می توان مستقیماً برای تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی استفاده کرد. یک نمونه سلولی همگن همچنین ماده اولیه ای را برای کشت سلولی فراهم می کند، در نتیجه اجازه می دهد تعداد سلول ها به میزان زیادی افزایش یابد و رفتار پیچیده آنها تحت شرایط کاملاً تعریف شده یک ظرف کشت بررسی شود.